Wat is Shotgun Sequencing?

Shotgun sequencing is een methode van DNA-sequencing, waarbij een lange strook van DNA fysiek wordt opgesplitst in kleine (ongeveer 2. 000 base-pair) fragmenten die worden gekloond, volgorde, en gemonteerd met behulp van computer-analyse. Het werd ontwikkeld en beroemd gemaakt door Craig Venter van Celera Corporation. Venter ontwikkelde de techniek in 1996 tijdens het werk aan het Instituut voor Genome Research.

Venter opgericht Celera in 1998 met de missie van het menselijk genoom sequencen binnen drie jaar. Dit doel werd in rechtstreekse concurrentie met de reeds operationele Human Genome Project, een consortium van universiteiten werken samen om het menselijk genoom sequentie met behulp van een oudere strategie genaamd kaart-gebaseerde of BAC-to-BAC-sequencing. Deze methode bij het doorbreken van de eerste genoom in 150. 000 stukjes basenpaar genoemd BACs, het monteren van de BACs in orde is, en dan sequencing elke BAC in detail.

Whole genome shotgun sequencing omzeilt het creëren en in kaart brengen van BACs en begint rechts in met DNA-sequencing. Het proces begint met het verwerven van een steekproef van hoog moleculair gewicht DNA van het organisme van de rente en fysiek te breken in kleine stukjes door te slagen via een smalspoor spuit of sonicating zij, een manier van het breken van het monster met behulp van geluidsgolven. Shearing is een willekeurig proces, dus de volgorde van de fragmenten zal hebben enige overlap tussen hen. Shearing niet specifiek creëren van de 2000 basenpaar fragmenten die nodig zijn voor het rangschikken, in plaats van fragmenten van de gewenste grootte moet worden gezuiverd van het mengsel.

De volgende stap is om toetreding tot de DNA-fragmenten met een DNA-drager genaamd een vector. Dit proces staat bekend als klonen, en het creëert een sequencing bibliotheek waarvan de sequentie van een hele genoom wordt gemaakt. De volgorde van elke kloon in de bibliotheek wordt bepaald, en de computer analyse wordt gebruikt om te overlappen, of continue sequenties in elk fragment. Montage van de overlappingen creëert een "Contig," dat is een lange ononderbroken stuk DNA sequentie.

Shotgun klonen meestal zal resulteren in een aantal hiaten tussen contigs omdat sommige sequenties ontbreken in de bibliotheek door toeval. Hiaten kunnen worden ingevuld door het maken van een nieuwe bibliotheek of met behulp van bekende sequenties naar buiten uit te breiden van de Contig. Omdat shotgun sequencing sequenties DNA-fragmenten op willekeurige, vele fragmenten zijn meer dan eens sequentie, het creëren van een grotere zekerheid dat de volgorde juist is, dan wanneer elk fragment was slechts een of twee keer volgorde.

Het menselijk genoom sequentie werd zowel door het Human Genome Project met behulp van kaart-based sequencing en door Celera gebruik shotgun sequencing. Shotgun sequencing is nu de voorkeur voor andere vormen van genoom sequencing. Het volledige genoom van talrijke organismen, zoals de plant Arabidopsis thaliana , rijst, hebben de koe, hond, kip, chimpansee, rat, muis, kogelvis, en veel micro-organismen zijn sequentie deze manier.